Ergebnise



4. Ergebnise

4.1 Die Spätdifferenzierung der humanen Chondrozyten im Rippenknorpel

Gegenstand unserer Untersuchung waren die Präparation und die Kultivierung von humanen Chondrozyten in Agarose, die biochemischen und morphologischen Untersuchungen der humanen Chondrozyten und der Vergleich der humanen Chondrozyten mit den Hühnerchondrozyten, die aus dem 17d-embrynalen Sternum isoliert wurden. Am Anfang traten die im folgenden dargestellten Probleme auf, die zum größten Teil gelöst werden konnten.

4.1.1. Die Beseitigung der Probleme

4.1.1.1 Die Beschaffung des humanen Knorpels

Durch das Institut für Rechtsmedizin, das Institut für Anatomie und die Klinik und Poliklinik für Kinder- und Neugeborenenchirurgie der medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster wurde uns humaner Knorpel zur Verfügung gestellt. Wir waren mit diesen Einrichtungen so organisiert, daß wir den Knorpel unmittelbar nach der Entnahme erhielten.

4.1.1.2 Die Präparation

Anfangs haben wir zwei Arten von mikrobiologischen Kontamination bei den Knorpelproben festgestellt, erstens eine oberflächliche Kontamination, die durch Sezernierung und Präparierung des Knorpels vorkommt, zweitens eine Kontamination der Chondrozyten selbst. Um eine oberflächliche Kontamination, auszuschließen bzw. zu beseitigen, haben wir folgende Maßnahmen ergriffen:

1) Bei der Entnahme des Knorpels und seiner weiteren Bearbeitung sollte möglichst steril
gearbeitet werden. So haben wir beispielsweise die verwendeten Geräte und das Entnahmegut ständig mit 70% Alkohol besprüht.
2) Nach der Entnahme der Gewebe ist der Knorpel von anderen Geweben bedeckt. Um die oberflächliche Kontamination zu beseitigen legten wir die Probe daher für 10 Minuten in 70% Alkohol und wuschen sie danach zweimal gründlich mit Krebspuffer.Die Kontamination der Chondrozyten konnte nicht beseitigt werden, so daß diese Proben für die Studie unbrauchbar waren.
Die Effiziens der Verdauung des Knorpels und die Zellausbeute sind von den folgenden Faktoren abhängig:


1. vom Alter der Patienten
2. von der Dicke der Schnitte
3. von der Menge der Kollagenase B

Daher sollte nur Knorpel von weniger als 10 Jahre alten Patienten oder Probanden verwendet werden, sollte der Knorpel möglichst dünn geschnitten werden, und betrug die Konzentration von Kollagenase B mehr als 1,5 mg/ml.

4.1.1.3 Die Zellzahl

Wir haben Knorpel von Patienten aus verschiedenen Altersgruppen erhalten. Wie die Daten der Tabelle l zeigen, konnten aus den Knorpeln älterer Patienten in Bezug auf die Masse der Probe weniger Chondrozyten isoliert werden.
Zu Beginn wurde die Durchführung dadurch behindert, daß nicht genug Chondrozyten aus dem Gewebe zu isolieren waren. Aus diesem Grund gab es einige Experimente, deren Ergebnisse in der Tabelle l aufgeführt sind. Um eine vernünftige Methode zur Isolierung der Chondrozyten zu finden, haben wir zuerst von einem Entnahmegut je 2 Gramm Knorpel genommen und die Chondrozyten danach unterschiedlich isoliert. Die effektivste Vorgehensweise ist im Abschnitt „Material und Methode” beschrieben.

Alter Die Anzahl der Zellen /2g Gewebe
3 Jahre 8,000,000
5 Jahre 8,500,000
8 Jahre 6,200,000
10 Jahre 5,600,000
14 Jahre 3,000,000
16 Jahre 1,500,000
17 Jahre 1,500,000
21 Jahre 1,000,000
Tabelle 1: Die Anzahl / 2g Rippenknorpel der isolierten Zellen unterschiedlich alter Patienten

4.1.1.4 Die Vitalität

Während wir die Chondrozyten vom fötalen epophysären Knorpel kultiviert haben, haben wir eine verminderte Vitalität festgestellt. Daher haben wir schließlich nur noch Rippenknorpel verwendet.

4.1.1.5 Antikörper gegen Kollagen X

Wir verwendeten ein lyophylisiertes Kaninchenantiserum gegen recombinantes humanes Kollagen X, das wir von Prof. von der Mark erhalten haben und im Immunblot in der Konzentration von 0,33 g/ml – l  g/ml eingesetzt haben. Während der Arbeit haben wir festgestellt, daß dieser Antikörper außerdem noch mit Kollagen IX reagiert. Daher haben wir, wie im Abschnitt „Material und Methode” beschrieben, die Kollagene nach der Pepsin4 verdauung reduziert und alkyliert. Auf diese Weise ließ sich die gegen Kollagen X gerichtete Antwort des Antiserums spezifisch identifizieren und im Immunblot von derjenigen gegen Kollagen IX unterscheiden.

4.1.2 Untersuchung der terminalen Differenzierung in humanen Chondrozyten aus Rippenknorpel

4.1.2.1 Induktion der terminalen humanen Chondrozytendifferenzierung durch Serumkomponenten

i) Einfluß unterschiedlicher Konzentrationen von FKS (Fötales Kälberserum)
Bruckner et al, (1989) und Tschan et al, (1990) wiesen nach, daß 10 % FKS die volle Kaskade der Spätdifferenzierung bei Hühnerchondrozyten induziert, d. h. die Zellen proliferieren zuerst, das Volumen nimmt zu, und schließlich wird Kollagen X synthetisiert.
Daher stellte sich zunächst die Frage, ob dies auch bei humanen Chondrozyten von Rippenknorpel zu beobachten ist und ob 0.1 % oder l % FKS im Medium ebenfalls ausreichend für die Induktion der Differenzierung sind. Die Proliferation der Chondrozyten konnte durch Zählen einzelner Zellen auf repräsentativen Fotografien bestimmt werden, die nach verschiedenen Zeitintervallen von einer identischen Stelle der Zellkulturschalen gemacht wurden. Wie die Abbildung 4.12 zeigt, ist diese Methode am Anfang der Kulturperiode (bis 28 Tage) gut anwendbar, wogegen es später (nach 4-5 Wochen) zur Zellaggregation kommt, was die Zählung einzelner Zellen schwierig macht. Die Kollagensynthese wurde qualitativ nach der Pepsinverdauung mit anschließender Kollagenextraktion aus der Zell-Agaroseschicht mit SDS-PAGE bestimmt. Zur genaueren Bestimmung von Kollagen X wurde zusätzlich ein Immunblot mit lyophylisiertem Anti.
recomb. Human Kollagen X Serum durchgeführt. Dieses Kollagen X, das Auftretenden der Aktivität von alkalischer Phosphatase und die Induktion der Proliferation, gekoppelt mit einer erhöhten Matrixproduktion, gelten als biochemische Marker der terminalen Chondrozytendifferenzierung. Bei Kultivierung der humanen Chondrozyten mit 10 % FKS nahm neben der erhöhten Proliferation (Abb.4.14) und der gesteigerten Kollagensynthese (Abb.4.21) auch die Größe der Zellen zu (Abb.4.12M-P). Übereinstimmend mit dieser morphologisch sichtbaren Vergrößerung des Zellvolumens wurde unter den pepsinresistenten Kollagenen auch Kollagen X gefunden (Abb.4.17). Zusätzlich war Aktivität der alkalischen Phosphatase nachweisbar (Abb.4.16). Unter dem Elektronenmikroskop konnte das Abschnüren von Matrixvesikeln von den Chondrozyten im Extrazellulärraum beobachtet werden (Abb.4.23). Die anschließende Mineralisierung dieser Matrixvesikel wurde durch energiegefilterte transmissionelektronenmikroskopische Feinbereichs-Beugungsaufnahmen (SAESD) als apatitisches Mineral nachgewiesen. Dabei wurden die charakteristischen Gitternetzebenenabstände (d-Werte) des Hydroxylapatits (d002 =0.344 nm, d300=0.273 nm, etc.) mit den d-Werten von Hydroxylapatit aus der Röntgenbeugungskartei (ASTM-932) verglichen und identifiziert (Abb. 4.23b,c).
Wie in Abb. 4.12 zu sehen ist, induzieren Konzentrationen von 0,1 % und l % FKS im Gegensatz zu einem Gehalt von 10 % FKS im Medium nicht die Proliferation. 1% FKS stimuliert jedoch die Synthese von Kollagen II und XI pro Schale (Abb. 4.21). Die Zellgröße (Abb. 4.12 I-L) nimmt nur leicht im Vergleich zur serumfreien Kontrolle (Abb. 4.12 A-D) zu.
Hinsichtlich der anderen Marker ist weder Kollagen X (Abb.4.17) noch die alkalische Phosphatase-Aktivität (Abb.4.16) feststellbar. Wir gehen davon aus, daß bei einer Konzentration von 0,1 % und l % FKS nicht genügend Faktoren enthalten sind, um die terminale Differenzierung auszulösen. Um zu klären, welche Komponenten im fötalen Kälberserum für das Auftreten der terminalen Chondrozytendifferenzierung verantwortlich sind, mußte nun die Reaktion der Knorpelzellen auf die einzelnen Bestandteile des FKS betrachtet werden. Um diese Komponenten zu gewinnen, konnte entweder das Serum aufgetrennt oder auf Faktoren, deren Vorkommen im FKS bekannt ist, zurückgegriffen werden.
Für unsere Untersuchungen entschieden wir uns für die letztere Möglichkeit.
ii) Regulation der Chondrozytendifferenzierung durch isolierte Faktoren in serumfreier Zellkultur
Um die Regulation der terminalen Differenzierung zu studieren, ist es unerläßlich, in serumfreien Zellkulturen zu arbeiten. Durch das in unserem Labor erarbeitete serumfreien Kultursystem für Hühnerchondrozyten, in dem durch Zugabe von Antioxidantien (z. B. l mM Cystein) in voll definiertem Medium (DMEM) die Chondrozyten über lange Zeit vital bleiben und das auch auf humane Chondrozyten anwendbar ist, war es möglich, die Chondrozyten serumfrei zu kultivieren und die Effekte einzelner Signalmoleküle auf die Synthese des Kollagen X ohne Überlagerung mit anderen Serumfaktoren hin zu untersuchen.
Als wichtigste Wachstumsfaktoren, die getestet wurden, sind Thyroxin, Insulin, insulinähnliche Wachstum-Faktoren (IGF) und das C- und N-terminale Segment (#1-34 und #53-84) des Parathormons (PTH) zu nennen. IGF I ist seit 1957 (Salmon & Daughaday) als Sulfatierungsfaktor im Serum bekannt, Insulin gilt als wichtiger anaboler Stimulus im Fötus (De Pablo et al., 1985; Girbau et al., 1988), und Schilddrüsenhormon (Thyroxin, Trijodthyronin) ist für Wachstum und Entwicklung des Skelettes unentbehrlich (Lebvitz & Burch, 1975). In serumfreier Organkultur konnte außerdem gezeigt werden, daß Thyroxin am Reifungsprozeß der Chondrozyten beteiligt ist (Burch & Lebovitz, 1981 & 1982).
In einem Gemisch der gesamten Chondrozyten eines Sternums eines 17-tägigen Hühnerembryos konnte die terminale Differenzierung durch Thyroxin eingeleitet werden (Böhme et al, 1992). In unserer Agarosekultur stimulierten IGF I (100 ng/ml), Insulin (100 ng/ml) und Thyroxin (50 ng/ml) die terminale Differenzierung der Chondrozyten vom Rippenknorpel nicht.
Es sind weder Kollagen X (Abb.4.17) und alkalische Phosphatase (Abb.4.20) noch Proliferation (Abb.4.15) und Mineralisation nachweisbar gewesen, auch nicht nach längerer Kultivierungszeit. Allerdings fanden wir eine Stimulation der Synthese der Kollagene II und XI (Abb.4.21).
In vivo führt die Injektion von Parathyroidhormon (PTH) zu einer Stimulation des Knorpelwachstums (Havelken et al., 1979; Gunnes & Hock, 1984). Bereits innerhalb der Nebenschilddrüse, wie auch extraglandulär (u. a. Leber, Niere), wird PTH einem partiellen Fragmentierungsprozeß unterzogen, welcher hauptsächlich zur Entstehung dreier Fragmente (#) führt: #1-34, #28-48, #53-84 (die Zahlen entsprechen den Sequenzabschnitten des PTHMoleküls).
Neuere Studien belegen multiple Wirkspektren von PTH an Aorta, Gehirn, Haut, glatter Muskulatur, Leber, Knorpel und anderen Organen durch die zusätzliche Bioaktivität der ursprünglich als inaktiv geltenden „Spaltprodukte #28-48 und #53-84. Allerdings herrscht über die Struktur-Funktionsweise dieser mittleren Terminale und der C-Terminale Unklarheit.
Da zudem die PTH-Wirkungen nicht nur durch das „klassische” N-tereminale Fragment #1- 34 vermittelt wird, sondern sich das Spektrum durch die Aktivitäten der anderen PTHSpaltprodukte (#28-48, #53-84) erweitert, sollte die vorliegende Untersuchung als biochemische Vergleichsanalyse der bisher kaum untersuchten Wirkungen der Fragmente am Knorpel dienen. Der Nachweis wurde mit serumfreien Zellkultur-Studien mit humanen Chondrozyten aus Rippenknorpel auf der Ebene der Proliferation, der Kollagensynthese und der Aktivität der alkalischen Phosphatase geführt.
In Kulturen, die eine Konzentration von 10-8 M PTH-Spaltprodukte (#1-34 und #53- 84) enthielten, zeigte sich nach 21 Tagen keine Proliferation (Abb. 4.13). In Kulturen mit einer Zelldichte von 1,5 x 106 Zellen/ml wurde nach 48-stundiger Behandlung mit 10-8 M PTH (1-34) oder 10-8 M PTH (53-84) die Synthese von Kollagen X beobachtet (Abb.4.22).
Ähnlich wurde nach Gabe von PTH (53-84) die Produktion der ALP-Aktivität nach 12 Tagen nachweisbar. Diese erhöhte sich bis zu Tag 21 (4.20). Die alkalische Phosphatase wurde nach 12 Tagen nur durch das C-Terminal des PTH induziert. Bis zum 21. Tag erhöhte sich die Aktivität der alkalischen Phosphatase (Abb.4.20).

4.1.3 Gewebeuntersuchungen

4.1.3.1 Mineralisierung, alkalische Phosphatase und Kollagen

X als Marker für die Spätdifferenzierung in humanem Rippenknorpel Humaner Rippenknorpel, d. h. der knorpelige Anteil der Rippen zwischen knöchernem Teil und Sternum, bleibt bis zur Pubertät Knorpelgewebe. Obwohl er als hyaliner Knorpel bezeichnet wird, ist er vaskularisiert. Bereits postnatal oder spätestens am 17.
Lebenstag ist das Knorpelgewebe von arteriellen und venösen Gefäßen durchzogen. Sie dringen in den Knorpel vom Perichondrium ausgehend zentripetal und sorgen durch mediale Verzweigungen für eine gute Versorgung des Gewebes mit Blut. Durch zunehmendes Dickenwachstum werden die zentral liegenden Chondrozyten durch Diffusion nicht mehr ausreichend ernährt, weshalb diese Zellen vermutlich angiogene Faktoren freisetzen, die die Vaskularisierung induzieren, damit ihre Versorgung wieder gewährleistet ist (N. Nuss, 1990). Im Rahmen der normalen Alterung setzt am Ende der Pubertät teilweise eine Mineralisation und Ossifikation des Rippenknorpels ein (Helly, 1929; Fischer, 1954). Diese Osteogenese kann auch als degenerativer Prozeß betrachtet werden, der eine Folge mangelhafter Versorgung der zentral liegenden Chondrozyten sein könnte (Fischer, 1954; Sames, 1977; Sames & Wöbet, 1980). Nach histochemischen Untersuchungen des Knorpels der ersten Rippe von Kindern und Erwachsenen wurde kein Kollagen X, nach der Pubertät jedoch alkalische Phosphatase nachgewiesen (Classen et al., 1995).
Um die Spätdifferenzierung im Rippenknorpel festzustellen, haben wir Rippenknorpel extrahiert und Kollagen X und alkalische Phosphatase-Aktivität biochemisch identifiziert.
Dazu wurde Kollagen X mit 4.5 M Guanidin / HCl (pH 7,4) aus dem Knorpelgewebe isoliert. Im Immunblot mit Kaninchenantiserum gegen Kollagen X wurde dann Kollagen X mit einem Molekulargewicht von 52 kDa in verschieden alten Knorpeln nachgewiesen (Abb. 4.19). Nachdem wir Kollagen X in den Knorpeln identifiziert hatten, erwarteten wir dort ebenfalls alkalische Phosphatase zu finden. Die aus dem Gewebe extrahierte alkalische Phosphatase wurde mit p-Nitrophenolphosphat für 30 min. bei 37°C inkubiert und die Extinktion bei 405 nm photometrisch bestimmt. So konnten wir im Knorpelgewebe von Spendern vor der Pubertät keine alkalische Phosphatase nachweisen. Bei 17-, 27-, 32-, 36-, 37- und 52-jährigen Spendern war eine Aktivität der alkalischen Phosphatase messbar (Abb. 4.18). Wir vermuten daher, daß die alkalische Phosphatase erst nach der Pubertät im Knorpelgewebe synthetisiert wird. Da die alkalische Phosphatase und Kollagen X Marker für die terminale Differenzierung sind, haben wir angenommen, daß sich nach der Pubertät auch eine Mineralisation des Knorpels zeigt. Glutaraldehydfixiertes Gewebe wurde im Elektronenmikroskop untersucht. In Geweben, in denen die alkalische Phosphatase nachweisbar war, konnte auch eine Mineralisierung festgestellt werden (Abb. 4.24a).

4.1.3.2 Ossifikation in humanem Rippenknorpel

Wie beschrieben haben wir Mineralisierung, ALP-Aktivität und Kollagen X als Marker für die Spätdifferenzierung in humanem Rippenknorpel nach der Pubertät festgestellt.
Daher erwarteten wir, daß dieses Gewebe ossifiziert wird. Bei einem 37-jährigen Mann konnten wir daraufhin eine Ossifikation in EM-Schnitten beobachten (Abb.4.24b). Aufgrund dieser Feststellung gehen wir davon aus, daß der humane Rippenknorpel nur teilweise ossifiziert.
Diese Vermutung ist konsistent mit der Folgerungen des Arbeitens von Koebke und Saternus, 1982 & 1985).

4.1.4 Abbau von Kollagen X

Wie in der Einleitung bereits erwähnt, besitzt Kollagen X zwei Imperfektionen der tripelhelikalen Sequenz mit der Aminosäureabfolge (Gly-X-Y-Z-A), die durch die Kollagenase abgespalten werden (Welgus et al., 1990). Im Gegensatz zu den durch die Kollagenase abgespaltenen Fragmenten der übrigen Kollagentypen wird das 32-KDa- Fragment des Kollagens X bei 37°C nicht sofort weiter abgebaut (Gadher et al., 1990).
Nach 45 Tagen konnte dieses Fragment auch in unseren Kulturen nachgewiesen werden (Abb.4.17).

Abb.4.12: Die Entwicklung von Rippenknorpelchondrozyten in Vitro Phasenkontrastlichtmikroskopische Aufnahme von Zellen unter Zugabe von 0,l %igen KKS (E-H), l %igen FKS (I-L), 10 %igen FKS (M-P). Kontrollzellen (A-D) wurden nur mit DMEM kultiviert.
Die Aufnahmen wurden nach 7 Tagen (A,E,I,M), 14 Tagen (B,F,J,N), 21 Tagen (C,G,K,O), und 28 Tagen (D,H,L,P) wiederholt Die identische Stelle der Zellkulturschalen wurde durch ein Phasenkontrastmikroskop vergrößert und fotografiert. (Zeiss Axiovert 10) Es werden repräsentative Stellen gezeigt.

Abb.4.13: Die Entwicklung von Chondrozyten des Rippenknorpels in in Vitro Phasenkontrast.
Lichtmikroskopische Aufnahme von Rippenchondrozyten in der Agarosekultur unter Zugabe von 100 ng/ml IGF1 (E-H), 100 ng/ml Insulin (I-L) 50 ng/ml Thyroxin (M-P), C-Terminal von PTH (Q-T)und N-Terminal von PTH (U-X).
Kontrollzellen (A-D) wurden nur mit DM KM kultiviert.
Die Aufnahmen wurden nach 7 Tagen (A,E,I,M,Q,U), 14 Tagen (B,F,J,N,R,V), 21 Tagen (C,G,K,O,S,W), 28 Tagen (D,H,L,P,T,X) in Kultur genommen.
Die identische Stelle der Zellkulturschalen wurde durch ein Phasenkontrastmikroskop vergrößert und fotografiert (Zeiss Axiovert 10). Es werden repräsentative Stellen gezeigt.

4. Proliferation der Chondrozyten in serumhaltiger Zellkultur Tage in Kultur Abb.4.14: Zellproliferation unter der Wirkung von DMEM und verschiedenen Konzentration von FKS (alle oben beschrieben).
Die Zunahme der Zellzahl entspricht dem Bruchteil der Zellen, die auf einem Feld in der Kulturschale nach den angegebenen Kulturzeiten gezählt wurden, relativ zu den am ersten Kulturtag an derselben Stelle beobachteten.
Proliferation der Chonldrozyten in serumfreier Zellkultur Tage in Kultur Abb.4.15: Zellproliferation unter Wirkung von DMEM und verschiedenen Serumfaktoren (alle oben beschrieben).
Die Zunahme der Zellzahl entspricht dem Bruchteil der Zellen, die auf einem Feld in der Kulturschale nach den angegebenen Kulturzeiten gezählt wurden, relativ zu dem am ersten Kulturtag an derselben Stelle beobachteten.

Tage in Kultur Abb. 4.16: Die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Kulturmedium der Rippenknorpelchondrozyten, die mit DMEM Medium und verschiedenen Konzentrationen von FKS kultiviert wurden.
Die Aktivität wurde anhand des Umsatzes des synthetischen Substrats (P Nitrphnol) photometrisch bestimmt.
Abb. 4.17 Immunblot pepsinierter und reduzierter Kollagene aus Chondro-zytenkulturen von Rippenknorpel, die in Agarose in 21 Tagen mit DMEM (Bahn 1), 0,1% FKS (Bahn 2), 1% FKS (Bahn 3), 100 ng/ml IGF, (Bahn 4), 100 ng/ml INS (Bahn 5), 50 ng/ml Thyroxin (Bahn 6), 10% FKS (Bahn 7) und in 45 Tagen mit 10% FKS (Bahn 8) kultiviert wurden.

A.P. Aktivität im Gewebe 0 3 8 11 17 27 32 36 37 52 Alter / Jahre
Abb.4.18: Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde nach Extraktion der Gewebe (Rippenknorpel) mit Triton durch die Bildung von Nitrophenol bestimmt.
Abb.4.19 Immunblot zum Nachweis von Kollagen Typ X nach Extraktion der Kollagene aus Rippenknorpel (20 mg) in 4,5 M Guanidin. Es handelt sich hierbei um Gewebeproben von 3 Jahre (Bahn 1), 11 Jahre (Bahn 2), 17 Jahre (Bahn 3) und 37 Jahre (Bahn 4) alten männlichen Probanden.  Kollagen Typ X (52 kDa)

A.P. Aktivität/ Schale Tage in Kultur Abb. 4.20: Die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Kulturmedium der Rippenchondrozyten, die mit DMEM Medium und verschiedenen Serumfaktoren (oben alle beschrieben) kultiviert wurden.
Die Aktivität wurde anhand des Umsatzes des synthetischen Substrats P-Nitrophenolat gemessen. Die Konzentration des gelb gefärbten Reaktionsprodukts (P-Nitrophenolat) wurde photometrisch bestimmt.

Abb. 4.21: Das Gel (Bahne 1-7) zeigt die Coomasie-Blau-Färbung der synthetisierten Pepsin-resistenten Kollagene, die durch SDS-PAGE (4,5-15
%) aufgetrennt wurden. Die Zellen wurden in DMEM (Bahn 1), 0,1 % FKS (Bahn 2), 1% FKS (Bahn 3), DMEM+100ng/ml IGF1 (Bahn 4),
DMEM+100ng/ml INS (Bahn 5), DMEM+50ng/ml Thyroxin (Bahn 6) und 10% FKS (Bahn 7) bei einer Zelldichte von 1,5 Mio Zellen /ml in Agarose
kultiviert.
Abb. 4.22: Immunblot pepsinierter und reduzierter Kollagene aus Chondrozytenkulturen von Rippenknorpel, die in Agarose 48 Stunden mit DMEM (Bahn 1), 10-8 M N-terminales Fragment von PTH (#1-34) (Bahn 2) und 10-8 M C-terminales Fragment von PTH (#53-84) (Bahn 3,4) kultiviert wurden.
4 Ergebnisse 71
(a) M: 44.000 x
(b) M: 12000 x

Abb.4.23 Matrixvesikel-Mineralisierung in humaner Chondrozyten-Kultur

(a) Abschnürung eines MV vom Chondrozyten (zero-loss gefilterte ESI-Aufnahme)
(b) Mineralisierung eines MV (zero-loss gefilterte ESI-Aufnahme)
(c) Feinbereichsbeugung des mlnerallsierten MV (zero-loss gefilterte ESD-Aufnahme)

Die elektronenmikroskopischen Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. U. Plate zur Verfugügung gestellt.

Abb. 4.24: Mineralisierung und Ossifikation von humanem Rippenknorpel
(a) mineralisierter MV im Rippenknorpel
(b) Ossifikation im Rippenknorpel

Die elektronenmikroskopischen Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. U. Plate zur Verfügung
gestellt.

4.2 Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten

Funktion, Transport und Speicherung von Zink wurden bereits in der Einleitung ausführlich besprochen. Wie beschrieben, ist die Prokollagen-N-Protease ein Metalloenzym, das wahrscheinlich im endoplasmatischen Retikulum posttranslational modifiziert und danach an die Zelloberfläche sezerniert wird. Dort spaltet es das aminoterminale Propeptid von Prokollagen ab. Das Ergebnis dieses Prozessierungsschnittes ist die Entstehung von entweder Kollagen II oder pC-Kollagen, das teilweise prozessierte Prokollagen II, welches das C-terminale Propeptid noch enthält.
In der vorliegenden Arbeit haben wir eine Aktivitätsändening der Prokollagen-NProtease in Chondrozyten aus Knorpel von Trichterbrustpatienten verschiedenen Alters in Abhängigkeit von der Zinkkonzentration in der Kulturmedien nachweisen können. Die
Aktivität der Prokollagen-N-Protease wurde durch den Grad der Prozessierung von pNKollagen II bestimmt.

4.2.1 Biochemische Analyse

Als Operationsmaterial von kostaler Knorpel wurde in der Klinik für Kinderchirugie der WWU durchgeführten Korrekturoperationen von Trichterbrustdeformitäten erhalten.
Normales Rippenknorpel von Spendern vergleichbaren Alters stammte aus dem Institut für Rechtsmedizin. Chondrozyten wurden aus Rippenknorpel isoliert und in Agarose
eingebettet. Die Agarosekulturen wurden serumfrei in Medien mit Zink und ohne Zink kultiviert. Nach erfolgter Kultur wurden die Zellen metabolisch mit [14C]-Prolin markiert und die neu produzierten Kollagene durch Elektrophorese und Fluo-rographie quantitativ erfaßt.

4.2.1.1 Nachweis von pN-Kollagen II

Ein Teil der neusynthetisierten Kollagenmoleküle wird n icht in die denovo gebildete
M a t r ix d er C ho nd ro z y ten in Ag a ro s e k u l tur e in ge b a ut un d d if fun d ie rt d e sh a lb in d ie Kulturmedien. Prokollagen II tritt dort unter normalen Umständen als vollständig zu Kollagen II prozessiertes Material auf. In der SDS-Gel-Elektrophorese der radioaktivmarkierten Medienproteine tritt deshalb die al(II)-Kette mit einem Molekulargewicht von 95kDa auf. Ein Teil des Proteins erscheint jedoch als pN-al(II)-Ketten, die eine etwas geringere elektrophoretische Mobilität besitzen und deren Menge davon abhängig, wie stark Prokollagen II durch die Prokollagen-N-Protease prozessiert wird. Chondrozyten von Trichterbrustpatienten wurden in Agarose eingebettet. Nach 20 Tagen in Kultur wurden die Kollagene aus den Medien extrahiert. Danach wurden die Kollagene mit und ohne vom fötalen Kalb stammenden Prokollagen-N-Protease in 50mM Natrium Cacodylat-Puffer pH 7,5 200mM KCl, 2mM CaCl, 2,5 NEM, 0.5mM PMSF, und 0,02% Brij 16 Stunden bei 26 °C inkubiert. Nach 16 Stunden Inkubation wurde die Reaktion mit 50 ml EDTA-Lösung (0,2M EDTA, PH 8, 0,5% SDS, 0,5M DTT) gestoppt und die Kollagene einer SDSGelelektrophorese unterzogen. Wie die Abbildung 4.25 zeigt, verschwand die Bande x oberhalb von Kollagen II durch Inkubation der Kollagene mit der Enzym. Die Bande x (Abb. 4.25) entspricht somit pN-Kollagen II. Durch die Inkubation mit der PN-Peptidase wurde das pN-Kollagen II in Kollagen II prozessiert.
Abb. 4.25: Konversion von pNKollagen durch die Prokollagen- N-Protease. SDS-Gelelektrophorese der Medienproteine mit (+) und ohne (-) vorangegangene Behandlung mit dem Enzym.
Darstellung der Polypeptide: Coomassie-Blau

4.2.1.2 Nachweis des Effekts von Zink auf die Prozessierung von Kollagen II

Zur Darstellung des Effekts von Zinkionen auf die in Agarose kultivierten Trichterbrustchondrozyten diente die Aktivität der Prokollagen-N-Protease. Diese wiederum wurde über den Grad der Prozessierung von Kollagen II ermittelt. Chondrozyten wurden zuerst aus dem Trichterbrustsknorpel isoliert und in Agarose eingebettet. Danach wurden die in der Agarose eingebetteten Chondrozyten mit Zink (DMEM + 15 mmol ZnSO4) und ohne Zink (nur DMEM) serumfrei kultiviert. Das Medium DMEM enthält kein Zink.
Die Kulturen mit und ohne Zink wurden nach 20 Tagen in Kultur mit [14C]-Prolin über 48 Stunden markiert. Die markierten Kollagene der Kulturmedien wurden zur Herstellung eines Fluorogramms verarbeitet.
In der unten stehenden Abbildung des Fluorogramms ist die pN-Kollagen II-Bande oberhalb der Kollagen II-Bande (Bahn l). Durch Zugabe von Zink wurde pN-Kollagen II
verstärkt zu Kollagen II prozessiert (Bahn 2). Dieses Phänomen beweist einen Effekt von Zink auf die Prozessierung von Kollagen II.
Abb. 4.26 zeigt die Verstärkung der Prozessierung von pNKollagen II durch Zugabe von Zink (15 mM ZnSO4) in serumfreien Kulturen (nur mit DMEM). Die Kulturen mit Zink
(DMEM + 15 mM ZnSO4) Bahn (1) und ohne Zink (DMEM) Bahn (2) wurden nach 20 Tagen in Kultur mit [14C]-Prolin während 48 Stunden markiert.
Darstellung der Polypeptide: Fluorogramm Alter: 7 Jahre

4.2.1.3 Die Verstärkung des Effekts von Zink durch 100 ng/ml Insulin

Insulin ist als ein wichtiger anaboler Stimulus in der Fötalentwicklung bekannt (De Pablo et al. 1988; Hill 1978). Es gibt nach unseren heutigen Erkenntnissen keine
Informationen darüber, daß Insulin den Effekt von Zink auf die Prozessierung von Prokollagene verstärkt. Trichterbrustchondrozyten wurden 4 Kulturbedingungen ausgesetzt:
mit Zink (DMEM + 15 mmol ZnSO4), ohne Zink (DMEM),
mit Insulin und Zink (DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15 mmol ZnSO4) und Insulin ohne Zink (DMEM + 100 ng/ml Insulin)
Die Kulturen wurden nach 20 Tagen in Kultur mit [14C]-markierten Prolin während 48 Stunden inkubiert und metabolisch die markierten Kollagene im Kulturmedium durch SDSGelelektrophorese und Fluorographie nachgewiesen. Wie die Abbildung 4.27 des Fluorogramms zeigt, wird die Prozessierung von Kollagen II durch Zugabe von Insulin und Zink verstärkt.
Abb. 4.27 zeigt die Verstärkung des Effekts von Zink auf die Prozessierung durch Zugabe von 100 ng/ml Insulin. Die Zellen wurden mit DMEM (Bahn 1), DMEM + 15 mM Zink (Bahn 2), DMEM + 100 ng/ml Insulin (Bahn 3) und DMEM + 100 ng/ml Zink
(Bahn 4) kultiviert und nach 20 Tage mit [14C]- Prolin über 48 Stunden
markiert.
Darstellung der Kollagene: Fluorogramm
Alter: 6 Jahre

4.2.1.4 Vergleich des Effekts von Zink auf Trichterbrustchondrozyten und kostalen

Chondrozyten von normalen Spendern

Wir haben an den Trichterbrustchondrozyten gezeigt, daß Zink einen Effekt auf die
aminoterminale Prozessierung von Prokollagen II hat. Wir nehmen an, daß die
herabgesetzte Prozessierung von pN-Kollagen II entweder mit einem Zinkmangel in den
Trichterbrustchondrozyten oder der ungenügenden Aktivität der Prokollagen-N-Protease in Verbindung steht.
Deswegen haben wir den Effekt von Zink auf kostalen Chondrozyten von normalen
Spendern untersucht. Wir haben die Chondrozyten aus Rippenknorpel eines
vergleichbaralten normalen Spenders (5 Jahre alte Junge) isoliert, in Agarose eingebettet und mit Zink (DMEM + 15 mmol ZnSO4) und ohne Zink (DMEM) kultiviert. Nach 20 Tagen wurden Kulturen mit [I4C]-Prolin während 48 Stunden markiert und die markierten Kollagene zur Herstellung eines Fluorogramms verarbeitet. Wie Abbildung 4.28 zeigt, hat sich die Prozessierung von pN-Kollagen II durch Zugabe von Zink in der Agarosekultur nicht verändert.
Weil die Zugabe von Zink in die Kulturmedien keinen Einfluß auf die Prozessierung
von Prokollagen II hat, können wir schließen, daß gesunde Chondrozyten normaler Spender ausreichend Zink enthalten, um die Produktion von aktiven Enzym auch während der gesamten Kulturzeit zu gewährleisten und Prokollagen-N-Protease in gesunden Chondrozyten normal ist.
Abb. 4.28 zeigt, daß Zink keinen Effekt auf die Prozessierung von Prokollagen II in kostalen Chondrozyten von normalen Spendern hat. Die Zellen wurden mit DMEM (Bahn 1) und DMEM + 15 mM Zink (Bahn 2) kultiviert und nach 20 Tage mit [14C]-Prolin während 48 Stunden markiert.
Darstellung der Kollagene: Fluorogramm
Alter: 5

4.2.2 Laborchemische Analyse

Zwei Untersuchungskollektive sind gebildet worden. Das Kollektiv I (Normalkollektiv)
war aus vier Rippenknorpelproben zusammengesetzt, die im Institut für Rechtsmedizin
von Probanden entnommen wurden, die keine Trichterbrust aufwiesen und die durch einen Unfall ums Leben kamen.

Das Alter dieser Personen lag zwischen 4 und 10 Jahren. Das Kollektiv II wurde von vier weiteren Knorpelproben gebildet, die bei einer Operation zur Trichterbrustkorrektur Kindern im Alter von 2,5 bis 7 Jahren entnommen wurden. Aus diesen Gewebeproben wurden die Chondrozyten gewonnen. Zur Bestimmung des Gehalts dieser Zellen an Zink, Kalzium und Kupfer durch Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (ICP-MS) und des Gehalts an DNA wurden jeder Probe 2 Millionen Zellen entnommen. Diese wurden in einem 15-ml-Falcon-Tube mit l ml deionisiertem Wasser lysiert. 100 ml dieser Suspension wurden für die DNA-Bestimmung und 900 ml für die Bestimmung der Ionenzusammensetzung verwendet. Die Ergebnisse der Proben 1-4 (in mg/Kg=ppm) wurden nach den Doppelbestimmungen mit (sn) bezogen auf 900mL Ausgangslösung in pMol/Zelle umgerechnet. Das Gesamt-DNA-Gewicht der normalen Chondrozyten und der Trichterbrustchondrozyten war in etwa gleich. Dieses zeigt zusammen mit der Zellzahlbestimmug, daß gleich viele Zellen von normalen Chondrozyten und Trichterbrustchondrozyten für diese Untersuchung verwendet worden sind.
Spurenelementanalytische Untersuchungen von Trichterbrustknorpel (Rupprecht et al.,
1987) ergaben einen hoch signifikanten Zinkabfall bei gleichzeitig erhöhtem Calciumgehlt gegenüber einem gesunden Kontrollkollektiv. Wir schließen aus unserer  aborchemischen Analyse das gleiche Ergebnis.

Die statistische Überprüfung der einzelnen Werte für den Gehalt an Zink, Kalzium und
Kupfer in kostalen Chondrozyten von Trichterbrustpatienten zeigt einen signifikanten
Mangel an Zink und Kupfer. Im Vergleich zu kostalen Chondrozyten von normalen
Probanden ist die Konzentration dieser Ionen etwa halb so groß. Dagegen war der Gehalt an Kalzium mehr als doppelt so hoch. Proben-Nr.
Angabe der Standardabweichung (sn-1), bezogen auf 900 mL Die Isotope 66Zn, 65Cu und 44Ca wurden bestimmt, da z.B. dieses Zn-Isotop bei den vorhandenen Ca-Konzentrationen nicht gestört wird. Durch P. Quint (1998) wurde beschrieben, daß alle Zn-Isotope bei hoher Ca-Konzentration und 63Cu durch ein Ar- Na-Molekülion gestört werden (P. Quint und K.D. Richter 1996).
Die laborchemische Analyse wurden freundlicherweise von Dr. P. Quint zur Verfügung gestellt.

4.2.3 Die Ursache von Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten

Wir haben biochemische und physikalische Hinweise erhalten, daß in Trichterbrustchondrozyten die Zinkionen-Konzentration erniedrigt ist. Warum die Trichterbrustchondrozyten weniger Zink enthalten, wissen wir allerdings nicht. Um die Ursachen des Zinkmangels in Trichterbrustchondrozyten zu finden, haben wir verschiedene Überlegungen angestellt. So sehen wir als Ursachen für den Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten im Vorfeld drei Möglichkeiten:
i) Störung der Zinkaufnahme
ii) Störung der Zinkspeicherung
iii) Störung des Zinktransports in der extrazellulären Matrix oder über die Plasmamemberan der Chondrozyten hinweg


Es ist zu bemerken, daß die nachfolgenden Ergebnisse nur für freie Zinkionen in vitro
definierten Agarosekultur gelten.

4.2.3.1 Störung der Zinkaufnahme

Wir haben im Rahmen des biochemischen Nachweises ausführlich über den Zinkeffekt
gesprochen. Dabei haben wir herausgestellt, daß Zink einen Einfluß auf die Prozessierung
von Prokollagen II hat. Da das der Agarosekultur zugegebene Zink über die Prokollagen-NProtease einen Einfluß auf die Prozessierung von Prokollagen II nimmt, können wir davon
ausgehen, daß freie Zink in den Chondrozyten aufgenommen wird und an Prokollagen-NProtease gebunden wird.

4.2.3.2 Störung der Zinkspeicherung

Zink kommt intrazellulär wahrscheinlich nicht in freier Form gebunden vor, sondern vorzugsweise an einem Trägerprotein, wie Metallothionein. Unser Ziel war es daher, durch die folgende Untersuchung eine Zinkspeicherung in den Chondrozyten nachzuweisen, um die Hypothese einer diesbezüglichen Störung verwerfen zu können. Aus isolierten Trichterbrustchondrozyten wurden Agarosekulturen vorbereitet und nach folgender Methode unterschiedlich mit oder ohne Zink kultiviert: Zwei Schalen wurden am ersten Tag für 48 Stunden mit Zink (DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15 mmol ZnSO4) inkubiert (Abb. 4.29 Bahn 1,2). Nach dreimaligem Waschen mit DMEM wurden diese bis zum 20. Tag des Experiments ohne Zink mit (DMEM + 100 ng/ml Insulin) kultiviert und anschließend für 48 Stunden mit [I4C]-Prolin markiert. Zwei weitere Schalen wurden nach 20 Tagen Kultivierung mit DMEM 100 ng/ml Insulin zunächst mit Zink (15 mmol Zinksulfat) inkubiert und dann mit l mCi/ml C14-Prolin für 48 Stunden markiert (Abb. 4.29 Bahn 3,4).
Die markierten Kollagene aller Schalen haben wir zur Herstellung eines Fluorogramms weiterverarbeitet.
Wir sehen keinen Unterschied in Bezug auf die Prozessierung von Prokollagen II zwischen Kulturen, die am Anfang mit Zink inkubiert wurden, und solchen, bei denen dies erst nach 20 Tagen geschah. Aus diesem Ergebnis schließen wir, daß das im Medium von
Agarosekulturen zugegebene Zink unter diesen Bedingungen innerhalb von 48 Stunden in die Trichterbrustchondrozyten aufgenommen oder/und an Zellmembran gebunden und dort gespeichert werden kann.

4.2.3.3 Störung des Zinktransports in der extrazellulären Matrix der Trichterbrustchondrozyten

Es ist noch nichts Näheres darüber bekannt, in welcher Form Zink im extrazellulärem Raum transportiert wird. Im Serum bindet sich Zink an Albumin und bildet mit diesem eine Transportform, die im Blut zirkuliert. Ob Zink als Ion oder zusammen mit einem Protein als Transportprotein in die extrazelluläre Matrix transportiert wird, wissen wir nicht. Ebenfalls unbekannt ist, wie lange das Zink braucht, um die extrazelluläre Matrix zu passieren und die Zellen zu erreichen. Ein Aspekt unserer Überlegung war, wie der Transport von Zink in die extrazelluläre Matrix nachzuweisen sei. Dafür haben wir dünn geschnittene Trichterbrustknorpel zu je 2 g einmal in einer Schale als Trichterbrustknorpelgewebe mit Zink (DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15 mM ZnSO2) inkubiert. Nach 10 Tagen wurden die Chondrozyten aus dem Gewebe isoliert und im gleichen Medium (DMEM + 100 ng/ml Insulin) in Agarose kultiviert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen in Agarosekultur mit [1 4C]-Prolin markiert und eine der Kulturen wurde zusätzlich mit 15 mM Zink inkubiert Abb.4.29 Bahn l und 2 entsprechen DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15 mM Zink (die Inkubation mit Zink im ersten und zweiten Tag der Kultivierung) Bahn 3 und 4 entsprechen DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15mM Zink (die Inkubation mit Zink nach 20 Tagen der Kultivierung)
Darstellung: Fluorogramm
Alter: 5 Jahre
pN-Kollagen II
Kollagen II

(Abb. 4.30 Bahn 1). Die markierten Kollagene wurden zur Fluorographie vorbereitet. Wie das untenstehende Fluorogramm zeigt, wurde keine Prozessierungsänderung beobachtet, obwohl die Chondrozyten im Gewebe vorher mit Zink inkubiert waren (Abb. 4.30 Bahn 3 und 4). Bezüglich der Prozessierung von Prokollagen II zeigen diese Chondrozyten keinen Unterschied zu den Zellen, die im Gewebe nicht mit Zink (Abb. 4.30 Bahn 2) inkubiert waren. Aus diesem Resultat läßt sich die Vermutung ableiten, daß freie Zn-Ionen innerhalb von 10 Tagen nicht durch die extrazelluläre Matrix von Trichterbrustchondrozyten diffundieren können. Wir wissen aber nicht, in welcher Form Zink in extrazellulären Matrix transportiert wird.
Abb.4.30 Bahn 1: Die Trichterbrustchondrozyten
wurden erst im Knorpel 10 Tage mit Zink inkubiert. Sie wurden dann aus dem Gewebe isoliert und weiter in Agarose kultiviert.
Nach 5 Tagen wurden die Zellen für 48 Stunden mit [14C]-Prolin markiert und gleichzeitig mit 15 mM Zink inkubiert.
Bahn 2: Die Chondrozyten wurden erst im Knorpel 10 Tage ohne Zink inkubiert. Sie wurden dann aus dem Gewebe isoliert und weiter in Agarose kultiviert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen für 48 Stunden mit 14C-Prolin markiert.
Bahn 3 und 4: Die Chondrozyten wurden erst im Knorpel 10 Tage mit 15mM Zink inkubiert. Sie wurden dann aus dem Gewebe isoliert und weiter in Agarose kultiviert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen für 48 Stunden mit 14C-Prolin markiert.
Darstellung: Fluorogramm
Alter: 8 Jahre
pN-Kollagen II
Kollagen II

4.3 Die Differenzierung der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in dreidimensionaler Matrix

Die Zellkulturtechniken, um Cytophysiologie und Cytobiochemie der Osteoblasten und deren Vorgänger zu studieren, sind vielfältig (Sodek und Berkman 1987; Majeska 1996). Kultursysteme, die Osteoblasten oder Osteoblasten-ähnlichen Zellen enthalten, sind für einige Spezies und verschiedene Hartgewebe etabiliert oder leiten sich von bestimmten Zellpopulationen auf der Line von osteogenen Vorläuferzellen ab.
Die Parameter für das prinzipielle Erstellen der Kulturen (d.h. Zusammensetzung des Mediums, Typus und Konzentration des Serums, Temperatur, Antibiotika) und die Methode ihrer Aufrechterhaltung (d.h. Ernährungsfrequenz, Isolation und Trennung, Arten der Kultivierung) sind sowohl in primären Kulturen mit einer minimalen Anzahl von Subkulturen oder Passagen, als auch in langlebigen permanenten Zellinien sehr verwandt.
Viele Primärsysteme repräsentieren an Osteoblasten reichhaltige Zellkulturen, nachdem sie aus Knochen der fötalen oder neugeborenen Nagetiere und anderer Spezies, inklusive des Menschen, isoliert wurden. Calvarien (Yeh et al. 1996; Naci et al. 1996; Chaudhari et al. 1997; Herbert et al. 1997; Lomri et al. 1997; Schirrmacher et al. 1997) sind besonders günstig, da ihre externen und internen Kortikalplatten einfach von dem Knochenmark zu trennen sind. Bei bisherigen Kulturen von osteogenen Vorlauferzellen gewinnt man Zellen aus harter Knochensubstanz, aus Periost oder aus Knochenmark (Nichols and Puleo 1997; Fromigue et al. 1998; Klein et al. 1998) oder aus embryonalen mesenchymalen Vorläuferzellen des Knochengewebes (Ong et al. 1998). Die Kultursysteme der permanenten Zellinien benutzen menschliche Osteosarcoma-Zellinien (Okamoto et al. 1998; Yellowley et al. 1998), untransformierte klonale Zellinien, wie die Maus-Calvariea entstammt der MC3T3-E1 Line 8 (Beck et al. 1998), und experimentelle unsterbliche Zellinien (Harris et al. 1995).

Im Gegensatz zu den oben genannten Zellkultursystemen, die mit zweidimensionalen gleichmäßigen Monolayern arbeiten, sind dreidimensionale Zellkultursysteme entwickelt worden, um eine poröse Matrix zu liefern, damit es möglich wird, daß Knochenzellen adherieren und in diesem System wachsen. Das verwendete Biomaterial bewegt sich zwischen synthetischen Polymeren (Attawia et al. 1995; Laurencin et al. 1996; Saat et al. 1998), bioaktiven Gläsern (El-Ghannam et al. 1997) und natürlichen Biomaterialen wie Kollagenen Schwämmen (Schoeters et al. 1992), denaturierten Schwämmen (Casser-Bette et al. 1990) und reinen Knochenmineralien (Tsuang et al. 1997). Da diese dreidimensionalen Kultursysteme sehr dicht sind, ist es nicht möglich, sie lichtmikroskopisch während der Kultivierung zu verfolgen. Eine weitverbreitete Kulturtechnik ist ein Gelkultursystem, welches das dreidimensionale Netzwerk der Proteoglycan-Polymere simuliert (Horwitz and Dorman 1970; Benya and Shaffer 1982).
Die primären periostalen osteogenen Vorläuferzellen sind multipotent, d.h. sie sind
auch in der Lage, in Chondrozyten zu differenzieren. Es bleibt jedoch unklar, ob sie diese
Eigenschaft auch nachträglich behalten, wenn sie in vitro bereits zu Osteoblasten-ähnlichen Zellen differenziert worden sind. In dieser Arbeit werden wir diese Frage beantworten und zusätzlich beschreiben, welchen Einfluß die verschiedenen Kultursysteme auf die Differenzierung von Zellen haben. Wir werden die Osteoblasten-ähnlichen Zellen biochemisch und morphologisch in verschiedenen Kultursystemen untersuchen.

4.3.1 Die Gewinnung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen

Die osteogenen Vorläuferzellen der Periost vom Rind wurden für etwa 4 Wochen in einem adhäsiven Zustand (zweidimensionale Monolyerkulturen) zusammen mit fötalem Rinderserum kultiviert. Früher ist gezeigt worden, daß die Zellen in so einem Kultursystem konfluent sind und morphologisch wie Osteoblasten aussehen (Jones et al., 1991).
Außerdem synthetisieren sie die Proteine wie alkalische Phosphatase, Osteocalcin, Osteonectin und Kollagen I. Diese differenzierten Osteoblasten-ähnlichen Zellen werden in folgende Kultursysteme transferiert und biochemisch und morphologisch untersucht.

4.3.2 Die Kultivierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in adhärenten Monolayerkulturen

4.3.2.1 Morphologische Untersuchungen

i) Lichtmikroskopische Untersuchung
Die nach vier Wochen im Monolayer-Kultur-System differenzierten Osteoblastenähnlichen Zellen wurden in Monolayerkultur passagiert. 5×105 in Monolayerkultur passagierten Osteoblasten-ähnlichen Zellen wurden mit 10% FKS kultiviert. Sie prolifederen und werden in der Zeit (etwa nach zwei Woche) konfluent. Die Zellen haben eine polygonale Form und bilden Fortsätze, durch die Zell-Zell-Kontakte gebildet werden (Abb. 4.31).
Zellfortsätze Abb. 4.31: Die lichtmikroskopische Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Monolayerkultur nach einer Wochen: Die Zellen wurden mit 10% FKS kultiviert und zeigen in einer Woche Fortsätze.

ii) Elektronenmikroskopische Untersuchung
Im Elektronenmikroskop werden ebenfalls langgestreckte Zellen beobachtet, die mit Nachbarzellen in Kontakt kommen. In der zytoplasmatischen Zusammensetzung sind sie ähnlich wie die Osteoblasten (gut entwickeltes rauhes endoplasmatisches Reticulum und ungewöhnlich lange Lysosome und Phagolysome) (Abb. 4.32).
Abb. 4.32 Die elektronenmikroskopische Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Monolayer-Kultur nach zwei Wochen: Die Zellen auf Monolayer-Schale wurden fixiert. Für die elektronenmikroskopische Aufnahme wurden Semidiinnschnitte angefertigt, die mit Uranylacetat fixiert sind. Die Zellen sind langgestreckt ähnlich der Osteoblasten mit gut entwickeltem rauhem endoplasmatischem Retikulum und ungewöhnlich lange Lysosome und Phagolysolysome.
Die Kontrastierung: 6000x
Die elektronenmikroskopische Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. T. Szuwart zur Verfügung gestellt.

4.3.2.2 Biochemische Untersuchungen

i) Kollagen-Synthese der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Monolayer-Kultur
Nach 14 Tagen haben wir die Kollagene mit [14C]-Prolin markiert. Die markierten Kollagene haben wir aus dem Medium extrahiert und zu einem Fluorogramm weiterverarbeitet.
Wie wir auf diesem Fluorogramm sehen (Abb. 4.35, Bahn 2), synthetisieren die Osteoblasten-ähnlichen Zellen drei Kollagene (Kollagen I, III, V).
Die obere Bande verschwindet nach Reduktion mit ß-Mercaptoethanol, welches charakteristisch für Kollagen III ist.
Lysosome und Phagolysome Osteoblasten-ahnhchen Zellen Nukleoli Fndoplasmatische Reticulum Boden der Schale

ii) Nachweis der alkalischen Phosphatase-Aktivität
Die Produktion von alkalischer Phosphatase nahm stark zu, stieg aber nicht kontinuierlich im Zeitraum von 2 Wochen (Abb. 4.36). Dies ist auch für authantische Osteoblasten
charakteristisch.

4.3.3 Die Kultivierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Agarose

4.3.3.1 Morphologische Untersuchungen

i) Lichtmikroskopische Untersuchung
Die Osteoblasten-ähnlichen Zellen wurden für 4 Wochen in Monolayer kultiviert, von der Schale durch Kollagenase-Behanlung abgelöst. 2×106 Zellen wurden in Agarose eingebettet und mit 10% FKS kultiviert. Unter dieser Bedingungen sehen die Zellen kugelförmig ähnlich der Chondrozyten aus. Im Gegensatz zu Monolayerkulturen beobachtet man weder Proliferation noch die Bildung von Zellfortsätze (Abb. 4.33).
Abb. 4.33: Lichtmikroskopische Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Agarose in zwei Woche: 2xl06 Zellen wurden in Agarose eingebettet und mit 10% FKS kultiviert. Die Zellen sehen unter dieser Bedingung ähnlich der Chondrozyten.

ii) Elektromiskroskopische Untersuchungen
Im Elektronenmikroskop zeigen die Zellen die typischen ultrastrukturellen Merkmale von Chondrozyten aus differenzierten Knorpeln (Bruckner et al., 1989). Einige dieser Merkmale sind die kugelförmige Gestalt und Kerne mit einem oder mehreren auffälligen Nuklei.
Abb. 4.34: Die elektronenmikroskopische Darstellung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in zwei Wochen in Agarosekulturen: die Zellen wurden in Agarose fixiert. Für elektronenmikroskopische Aufnahme wurde Semidünnschnitte angefertigt, die mit Uranylacetat kontrastiert sind. Die Zellen sind kugelförmig ähnlich der Chondrozyten und zeigen Kerne mit einem oder mehreren Nuklei.
Kontrastierung: 9.000 x
Die elektronenmikroskopische Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. T. Szuwart zur Verfügung gestellt.

4.3.3.2 Biochemische Untersuchungen

i) Kollagen-Synthese der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in der Agarose-Kultur

Nach 14 Tagen wurden die Kollagene mit metabolisch [14C]-Prolin markiert, pepsiniert, aus dem Medium extrahiert und zur Fluorographie verabeitet. Wie aus dem Fluorogramm ersichtlich ist, synthetisieren die Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Agarose Nuklei Kollagen II, jedoch kein Kollgen X, I (Abb. 4.35 Bahn 3). Durch die Markierung von pepsiniertem Kollagen II in einem Immun-blot mit monokolonalen Antikörpern gegen Kollagen II läßt sich die Anwesenheit von Kollagen II in Agarose-Kultur bestätigen.
Kollagen II ist ein Merkmal von Chondrozyten (Abb.4.35 Linie 4). Die Zellen synthetisieren keine Kollagene I und III, die Merkmale von Osteoblasten und mesenchymalen Vorläuferzellen sind.
Abb. 4.35: Die Darstellung von Kolljagen-Synthese der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in der Monolayerkultur (Bahn2) und Agarosekultur (Bahn 3,4) im Vergleich zu Standard (Bahn 1). Die Zellen in Agarosekultur synthetisieren Kollagen II.

ii) Nachweis der alkalischen Phosphatase-Aktivität

Die nach Kultur in Agarose phenotypisch modulierten Periostalzellen produzieren keine Aktivität der alkalischen Phosphatase. Daher haben die Zellen unter diesen Kulturbedingungen Osteoblasten-ähnlichen Eigenschaften aufgegeben.
Abb. 4.36: Die alkalische Phosphatase-Aktivität der Osteoblasten in verschiedenen Matrices: Die Aktivität der alkalischen Phosphatase von Zellen in Kollagen I-Gel steigt in ersten Tagen kontinuierlich. In Agarosekultur zeigen die Zellen keine Aktivität der alkalischen Phosphatase

4.3.4 Die Kultivierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen im Kollagen IGel

4.3.4.1 Morphologische Untersuchung

i) Lichtmikroskopische Untersuchung
Die 2×106 Osteoblasten-ähnlichen Zellen, die 4 Wochen in Monolayer kultiviert waren, wurden abgelöst und in Kollagen I-Gel weiter mit 10% FKS kultiviert. Nach 2 Wochen Kultivierung sehen die Zellen polygonal aus und entwickeln Fortsätze, durch die die Zellen miteinander in Kontakt kommen. Die Zellen bilden wie die Osteoblasten eine netzartige Struktur und proliferieren.

Abb. 4.37: Lichtmikroskopiscbe Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Kollagen I-Gel nach zwei Wochen. Die Zellen sind gestreckt ähnlich der Osteoblasten und bilden die Fortsätze.
Die Kultivierung: mit 10% FKS Zellzahl: 2×106 Zellen
ii) Elektronenmikroskopische Untersuchung
In elektronenmikroskopischer Untersuchung sehen wir langgestreckte Zellen, die aufgrund ihrer breiten Ausdehnung und ihrer Fortsätze mit den Nachbarzellen in Kontakt kommen. Hinsichtlich ihrer zytoplasmatischen Zusammensetzung sind sie ähnlich wie die Osteoblasten.
Abb. 4.38 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Kollagen I-Gel in zwei Wochen: Die Zellen in Kollagen I-Gel wurden fixiert. Für elektronenmikroskopische Aufnahme wurde Semidünnschnitte angefertigt, die mit Uranylacetat fixiert sind. Die elektronenmikroskopische Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. T. Szuwart zur Verfügung gestellt.

4.3.4.2 Biochemische Untersuchungen

i) Kollagen-Synthese der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Kollagen I-Cel
2×106 Zellen wurden in Kollagen I eingebettet und mit 10% FKS kultiviert. Nach 14 Tagen haben wir die Kollagene mit [14C]-Prolin markiert. Die pepsinresistenten und markierten Kollagene wurden zu einem Fluorogramm weiterverarbeitet. Wie das Fluorogramm (Abb. 4.39) zeigt, synthetisieren die Zellen Kollagen I und V. Bemerkenswert ist, daß die Zellen in Kollagen I-Gel im Gegensatz zu Monolayer-Kulturen kein Kollagen III synthetisieren.
Abb.4.39 Die Kollagen-Synthese von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Monolayerkultur (Bahn 3) und Kollagen I-Gel (Bahn 2) im Vergleich zum Standard (Bahn 1). Die Zellen wurden in Kollagen I-Gel eingebettet und mit 10% FKS kultiviert. Die Zellen in Kollagen I-Gel synthetisieren kein Kollagen III (Bahn II).
ii) Nachweis der alkalischen Phosphatase-Aktivität

Die Produktion alkalischer Phophatase wurde stark stimuliert. Die Zellen produzieren am 1. Tag alkalische Phophotase. Die alkalische Phosphatase-Aktivität nimmt während dieser Zeit zu. Somit zeigen die Zellen ein wesentliches Merkmal von Osteoblasten.

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